Патент Р.Ф. 2068265
Изобретение
Способ получения тромбоцитов.
Автор Лифановский В.А.
Способ получения тромбоцитов относится к гематологии. Цель изобретения - экономия крови и повышение степени очистки тромбоцитов. Тромбоциты культивируются в синтетической питательной среде. Способ включает операции: выделение тромбоцитов из крови дифференциальным центрифугированием, приготовление жидкой и твёрдой питательной сред, посев тромбоцитов в жидкую питательную среду, посев на твёрдую питательную среду, посев на жидкую питательную среду, выделение тромбоцитов из среды и их промывка солевыми растворами. Культивирование производится при температуре 0 - 440С в течение 1 - 45 суток при аэрации. Полученные тромбоциты и среда после культивирования в ней тромбоцитов могут быть использованы как сырьё при производстве лекарственных препаратов.
Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии и вопросу получения клеток крови и их заменителей.
Известен способ получения тромбоцитов, включающий последовательное центрифугирование индивидуальных доз крови с последующей отмывкой. При первом мягком центрифугировании крови осаждаются эритроциты и лейкоциты. При втором, более жёстком центрифугировании осаждаются тромбоциты. Полученные тромбоциты отмываются различными солевыми средами ("Клетки костного мозга и периферической крови", О.К. Гаврилов, Г.И. Козинец, Н.Б. Черняк, Москва, "Медицина",1985 г., стр.227 - 231).
Недостатком указанного способа получения тромбоцитов является то, что для его осуществления, для получения нужного количества тромбоцитов, требуется большое количество крови, которое может быть взято у нескольких доноров, которые должны быть подобраны по антигенам АВО и HLA, что сделать очень сложно ("Иммунобиология для практических врачей", Хью Р.К. Барбер, Москва, "Медицина",1980г., стр. 137 - 138).Очистка не обеспечивает освобождение тромбоцитов от примеси эритроцитов и лейкоцитов полностью, а также от веществ, преимущественно белковой природы, определённых плазмой крови, которые обволакивают тромбоциты толстым слоем снаружи ("Геморрагические заболевания и синдромы", З.С.Баркаган, Москва, "Медицина", 19890 г., стр. 14 - 15).
Целью настоящего изобретения является устранение указанных недостатков, т.е. создание способа получения тромбоцитов, полностью свободных от факторов, определённых плазмой крови и других форменных элементов её, имеющих наперёд заданные характеристики, и экономия крови.
Указанная цель достигается тем, что тромбоциты, полученные из малого количества крови путём дифференциального центрифугирования, помещают в среду, содержащую определённый набор химических веществ, и выдерживают в ней при определённых физических и химических условиях, при соблюдении условий строгой стерильности, т.е. дополнительно производится культивирование тромбоцитов в питательной среде, что и определяет возможность их получения в большом количестве, при минимальной затрате крови. Полученные таким способом тромбоциты не несут на своей мембране факторы, определяемые кровью донора. Выделение тромбоцитов из среды производится фильтрованием или центрифугированием с одновременной отмывкой солевыми средами. Среда, применяемая культивирования тромбоцитов, имеет следующие компоненты в мг/л:
Хлористый кальций 3 - 200
Хлористый калий 5 - 10000
Хлористый цинк 0,01 - 100
Натрий фосфорнокислый двухзамещённый 5 - 10000
Сульфат магния 0,01 - 100
Гексацианоферрат /11/ калия 0,01 - 200
DL лейцин 3 - 2000
DL серин 1,9 - 1500
DL триптофан 0 - 500
L цистеин 0 - 400
L гистидин 1,7 - 1500
L аргинин 0,6 - 500
L глютаминовая кислота 1,1 - 1000
DL метионин 0,5 - 500
L пролин 0,8 - 1000
L аспарагин 0,9 - 1000
DL лизин 0 - 700
L глютамин 0 - 500
Аминоуксусная кислота 0,3 - 500
Сахароза 100 -10000
Аденозинтрифосфат 0 - 2000
Фолиевая кислота 0,01 - 0,5
Тиамина бромид 0,01 - 1
Пангамат кальция 0,01 - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид 0,01 - 0,5
Цианокобаламин 0,01 - 0,5
Аскорбиновая кислота 0,01 - 1
Вода дистиллированная один литр
Сахаразу можно заменить инозитом, дульцитом или маннитом, взяв их в том же количестве.
Культивирование тромбоцитов возможно при условии восполнения потребляемого ими кислорода. Поэтому культивирование можно проводить в тонком слое при доступе к поверхности свежего воздуха, или применив продувание питательной среды воздухом мелкими пузырями, что дополнительно предотвращает агрегацию тромбоцитов.
Добавив в среду агар-агар, можно получить твёрдую питательную среду, при этом можно не вводить углеводы, т.к. тромбоциты разжижают агар-агар.
Культивирование можно производить в стеклянной посуде, но нужно учесть, что примеси в стекле влияют на интенсивность роста, поэтому желательно использовать кварцевое стекло. Форма посуды может быть любой.
Культивирование производится в термостате при температуре 0 - 440С в течение 1 - 50 суток. Первый этап развития культуры тромбоцитов, выделенных из крови, занимает длительное время, для его сокращения нужен редкий посев и отмывание тромбоцитов, например, 0,9% раствором хлористого натрия, перед посевом. Культура после последующих пересевов развивается быстрее. Срок развития может служить индикатором чистоты культуры.
Применяя известные методы пересева с жидкой питательной среды на твёрдую и обратно, можно добиться желаемой однородности и очистки тромбоцитов.
Экономию крови можно считать полной, т.к. она используется только для первоначального посева.
Конечным продуктом являются тромбоциты, образовавшиеся в результате некоторого деления исходных тромбоцитов, полученных из крови, при их росте и размножении на искусственной питательной среде. Поэтому способ даёт возможность получить нужное количество тромбоцитов, свободных от плазмы крови и антигенов, определяемых ею.
Пример конкретного исполнения.
Способ включает приготовление питательной среды, взятие крови, выделение и отмывку тромбоцитов, поспев, культивирование, выделение из среды культивирования и промывку.
Для приготовления 100 миллилитров питательной среды заготовляют навески следующих веществ в мг:
Хлористый кальций 5
Хлористый калий 300
Хлористый цинк 0,01
Натрий фосфорнокислый двухзамещённый 50
Сульфат магния 0,01
Гексацианоферрат /11/ калия 0,01
DL лейцин 3
DL серин 1,9
DL триптофан 0,37
L цистеин 0,28
L гистидин 1,66
L аргинин 0,63
L лютаминовая кислота 1,1
DL метионин 0,52
L пролин 0,76
L аспарагин 0,86
DL лизин 0,9
L глютамин 0,26
Аминоуксусная кислота 0,22
Сахароза 200
Фолиевая кислота 0,01
Пангамат кальция 0,01
Аминокислоты и витамины растворяются, каждая в отдельности, в 2 мл воды ( вода везде используется дистиллированная, фармакопейная). В чистую (вся посуда моется хозяйственным мылом, с последующей обработкой хромовой смесью) колбу, ёмкостью 250 мл, наливается 50 мл воды. В ней растворяют хлористый калий, хлористый кальций, хлористый цинк, натрий фосфорнокислый двухзамещённый, сульфат магния, гексацианоферрат/11/ калия и сахарозу. В полученный раствор вливают растворы аминокислот и витаминов. Объём раствора доводят водой дл 97,5мл. Колбу закрывают ватно-марлевым тампоном и раствор стерилизируют в автоклаве при давлении 0,5 атмосферы в течение 10 минут. В остывший раствор стерильно добавляют 2 мл 1%раствора аденозинтрифосфата и 0,5мл смеси следующего состава в мл:
Тиамина бромид 6% раствор 0,05
Пиридоксина гидрохлорид 5% раствор 0,05
Цианокобаламин 10% раствор 0,05
Аскорбиновая кислота 5% 0,05
разбавленных 10 мл воды.
30 мл полученной среды переливают в колбу емкостью 100 мл и к ней добавляют 750 мг выщелоченного агар-агара. На водяной бане добиваются растворения агара и полученный раствор разливают в две чашки Петри, которые стерилизуют в автоклаве при 0.5 атмосферы 10 минут. Твёрдую и жидкую питательные среды помещают в термостат на 72 часа при температуре 370С, для проверки стерильности. Одновременно среды обогащаются кислородом.
Культивирование производится в следующем устройстве пробирка с отводом закрывается резиновой пробкой с отверстием, в которое пропущена стеклянная трубка, доходящая до дна пробирки. Нижний конец трубки имеет отверстие диаметром 0,01мм. Снаружи в пробку вставляют керамический бактериальный фильтр, для стерилизации воздуха. Отвод пробирки закрыт плотной ватной пробкой и на него надета резиновая трубка, пережатая зажимом. Приготовленный прибор в двух экземплярах стерилизуется в автоклаве при 1 атм 0,5 часа. Пробирки заполняют жидкой питательной средой в количестве 10 мл каждая. Емкость пробирок с отводом 50 мл.
Для получения тромбоцитов, для посева берут 0,05 мл крови донора из пальца, кожу обрабатывают бензином, формалином, спиртом и йодом, под контролем ультрафиолетового облучения в настольном боксе, в который вводится только кисть донора, одетая в перчатку. Сделав укол прокалённой иглой, набирают в шприц 0,05 мл, в котором находится 5 мл 09% раствора хлористого натрия, энергично встряхивают и переносят в центрифужную пробирку, закрытую пробкой. Раствор крови центрифугируют при ускорении 4 м/с2 5 минут. Надосадочную жидкость переливают в чистую центрифужную пробирку и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/с2 10 минут. Надосадосчную жидкость отсасывают, оставляя в пробирке 0,1 мл жидкости. Содержимое пробирки разводят 5 мл 0,9% раствора хлористого натрия в воде и вновь центрифугируют при ускорении 24 м/с2 5 минут. Надосадочную жидкость сливают, содержимое пробирки перемешивают, для переведения тромбоцитов во взвешенное состояние. Смесь тромбоцитов переносят в пробирку с питательной средой.
Пробирка, с посеянными в питательную среду тромбоцитами, помещается в термостат в наклонном положении, под углом 300 к горизонту, при температуре 370С. через каждые два часа производится продувание питательной среды воздухом 2 минуты. Для этого резиновую грушу, выжав из неё воздух, соединяют с отводом пробирки, освобождают грушу и снимают зажим с трубки. Воздух проходит через питательную среду мелкими пузырями. Пробирку при этом располагают вертикально. Наличие роста проверяют, наблюдая раздавленную каплю в микроскопе при увеличении в 600 раз. Через 192 часа из пробирки производят посев на агаризованную среду, для проверки чистоты и выделения чистой культуры от одной клетки. Для этого, из пробирки петлёй набирают среду, растирают её по поверхности агаризованной среды и той же петлёй делают посев во второй чашке. Чашки помещают в термостат при 370С. через 48 часов наблюдают выросшие колонии в микроскоп при увеличении в 105 раз. Отдельные колонии тромбоцитов на гладкой поверхности агаризованной питательной среде имеют диаметр до 5 мм. Форма круглая, полупрозрачная. Поверхность блестящая, гладкая. Структура зернистая. Цвет светло-бронзовый, у молодых заметен только на просвет, напоминают каплю воды на поверхности при условии смачиваемости. Профиль выпуклый, край ровный, в месте плотного посева колонии сливаются. Консистенция студенистая в воде плохо эмульгируют. В толщу агара не развиваются. Отдельную колонию переносят во вторую пробирку. Культивирование производится при тех же условиях. За 48 часов происходит развитие тромбоцитов до плотности 2,4х109 в одном мл среды, при посеве 2 колоний диаметром 4 мм в 10 мл питательной среды. (Скорость развития культуры тромбоцитов при первых посевах сильно зависит от состояния здоровья донора).
Тромбоциты от среды отделяют центрифугированием при ускорении 24 м/с2. Надосадочную жидкость заменяют 0,9% раствором хлористого натрия, размешивают и вновь центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и в осадке получают тромбоциты.
Технико-экономическая или иная эффективность.
При посеве тромбоцитов в питательную среду с плотностью 106 клеток на один литр за 48 часов культивирования получается 2,4х1012 клеток, при этом, для первоначального посева использовалось 0,05мл крови. В одном литре крови здорового человека содержится в среднем 0,3х1012 тромбоцитов. Следовательно, для получения тромбоцитов один литр питательной среды заменяет 8 литров донорской крови, при условии 100% выхода тромбоцитов из последней.
Получаемые способом культивирования тромбоциты не содержат примесей, определяемых кровью донора.
Полученные таким образом тромбоциты могут быть использованы для производства лекарственных препаратов, и свойства их могут регулироваться составом среды.
Формула изобретения
Способ получения тромбоцитов, включающий выделение тромбоцитов из крови дифференциальнвым центрифугированием и отмывку их, отличающийся тем, что, с целью экономии и повышения степени очистки, выделенные тромбоциты культивируют при 00 - 440С в течение 2х105 - 3х106с при аэрации в питательной среде, содержащей следующие компоненты, мг /л:
Хлористый кальций 3 - 200
Хлористый
калий 5 - 10000
Хлористый цинк 0,01 - 100
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный 5 - 10000
Сульфат магния 0,01 - 100
Гексацианоферрат /11/ калия 0,01 - 200
Лейцин 3 - 2000
Серин 1,9 - 1500
Триптофан 0 - 500
Цистеин 0 - 400
Гистидин 1,7 - 1500
Аргинин 0,6 - 500
Глютаминовая кислота 1,1 - 1000
Метионин 0,5 - 500
Пролин 0,8 - 1000
Аспарагин 0,9 -1000
Лизин 0 - 700
Глютамин 0 - 500
Аминоуксусная кислота 0,3 - 500
Сахароза 100 - 10000
Инозит 100 - 10000
Дульцит 0 - 10000
Маннит 0 - 10000
Аденозинтрифосфат 0 - 2000
Фолиевая кислота 0,01 - 0,5
Тиамина бромид 0,01 - 1,0
Пангамат кальция 0,01 - 0,5
Пиридоксина гидрохлорид 0,01 - 0,5
Цианокобаламин 0,01 - 0,5
Аскорбиновая кислота 0,01 - 1,0
Вода дистиллированная до 1 л.
------------------------------------------------------------------------------------------------
Дополнение: культура тромбоцитов на указанной среде с агар-агаром, совершенно высохшем, может существовать 16 лет.